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化学品蜜蜂幼虫毒性试验
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1范围
本标准规定了化学品蜜蜂幼虫毒性试验的受试物信息、试验原理、试验方法概述、试验程序、质
量保证与质量控制、数据与报告。本标准适用于测试易溶于水、不挥发的化学品对蜜蜂幼虫一次性暴露的毒性。本标准不适用于难溶于水、易挥发的化学品。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 21812化学品蜜蜂急性经口毒性试验 GB/T 21813化学品蜜蜂急性接触性毒性试验 GB/T 21845化学品水溶解度试验 GB/T 21852化学品分配系数(正辛醇 -水)高效液相色谱法试验 GB/T 21853化学品分配系数(正辛醇 -水)摇瓶法试验 GB/T 21855化学品与pH有关的水解作用试验 GB/T 22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法 GB/T 22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在 10-1 Pa至105Pa范围内的测定静态法 GB/T 22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在 10-3 Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平衡法 OECD化学品测试导则 No.104蒸气压( VapourPressure) OECD化学品测试导则 No.112水中解离常数( Dissociation Constants inWater)
3术语和定义
GB/T 21812和GB/T 21813界定的术语和定义适用于本文件。
4受试物信息
受试物的以下信息有助于试验设计:
a)水中溶解度( GB/T 21845);
b)有机溶剂中的溶解性;
c)蒸气压( GB/T 22052、GB/T 22228、GB/T 22229和 OECD No. 104);
d)受试物结构式;
e)受试物纯度;
f)解离常数( pKa);
g)水中的化学稳定性(水解性, GB/T 21855);
h) 光解; 
i) 正辛醇 -水分配系数( GB/T 21852和 GB/T 21853); 
j) 受试物的物理性质及来源(批次、批号)。
由于理化性质使其很难检测的受试物,其指导信息见参考文献 10[10]。
5试验原理
在试验第一天( D1),从三个繁殖蜂巢中取出第一龄期( L1)蜜蜂幼虫(即同为一日龄的幼虫),分别放入 48孔细胞培养板,在板孔中人工标准化饲养。在试验第四天( D4),将一定范围的五个递增浓度的受试物、以饲料的方式一次性投喂给幼虫。记录试验第五天( D5)、第六天( D6)和第七天( D7)的死亡量。计算幼虫 72小时的 LD50(D7的累积死亡量)。
6参比物质
首选工业级的乐果( CAS RN. 60-51-5)为参比物质,用来验证试验系统和试验条件的可靠性。按含有活性物质的剂量 8.8±0.5μg/幼虫,将参比物质溶解于最多 3 μL水中,在试验第四天( D4)与常规饲料混合,然后投喂给蜜蜂幼虫 [2][3]。
7试验方法概述
7.1试验装置及准备
幼虫应在透明的聚苯乙烯育王台基中饲养,其内直径为 9 mm,深度为 8 mm。育王台基在试验开始时进行杀菌,如可用酒精或其它杀菌溶液浸泡 30min,取出后在通风橱中晾干。将育王台基每个格放置于48孔细胞培养板的一个小孔中。宜将一片牙科棉吸入加有 15%(重量 /体积)甘油的杀菌液 500 μL,放入孔的底部,使育王台基的顶部与培养板保持水平(见图 1)。
图 1培养孔中的幼虫单元格
将这些培养板放入密封的有机玻璃干燥器。为保持干燥器中空气水分饱和,其中放一个盛有硫酸钾(K2SO4)饱和溶液的培养皿。将干燥器放进一个配有强制空气循环系统的培养箱中,整个培养箱的温度保持在 34℃~ 35℃之间,并尽量使整个试验全过程的温度都保持在此范围内。
7.2供试生物及准备
7.2.1供试生物
采用意大利蜜蜂( Apis mellifera)幼虫为供试生物。
7.2.2幼虫的来源
从3个不同蜂巢的蜂群中收集幼虫,每个蜂巢的蜂群作为一个平行组(见 8.1)。蜂群应喂食充足、健康,无疾病和寄生虫。应知道它们的生活史和生理状态。
在蜂王产卵繁殖期进行实验。如果在对蜂巢卫生处理期间(例如杀螨或疾病治疗措施),应报告对蜂巢处理的日期及所用药物的特性。四星期内用抗生素和抗螨虫药物治疗的蜂群,不应用于试验。
在试验前四天( D-3),为确保幼虫分别来自 3个不同的蜂群,采取用一个隔离的笼子罩住一个空的蜂巢坯的方式,将 3只蜂王限制在各自的蜂巢中(见图 2)。将隔离的笼子紧挨着有蜂群的蜂坯。在试验前三天( D-2),检查有新蜂卵产出后,将蜂王从笼中移出(见图 3)。蜂王隔离不应超过 30h。宜减少隔离蜂王的时间,以便将同一蜂坯中幼虫在体型大小和虫龄之间的差异降至最低。将装有蜂卵的蜂坯留在笼中,孵化阶段一直放在蜂群边,直到孵化出幼虫( D1)。
图 2一个带隔离笼蜂房的横截面
7.3饲养材料的准备
7.3.1幼虫饲料
根据幼虫不同发育阶段的需要,日常的饲料按组分配比分为以下 3组:
a) 饲料
A(D1): 50%(重量)鲜蜂王浆 +50%(重量)水溶液,水溶液中含 2%(重量)的酵母膏, 12%(重量)的葡萄糖和 12%(重量)的果糖。
b) 饲料
B(D3): 50%(重量)鲜蜂王浆 +50%(重量)水溶液,水溶液中含 3%(重量)的酵母膏, 15%(重量)的葡萄糖和 15%(重量)的果糖。
c) 饲料
C(从 D4到 D6): 50%(重量)鲜蜂王浆 +50%(重量)水溶液,水溶液中含 4%(重量)的酵母膏, 18%(重量)的葡萄糖和 18%(重量)的果糖。
如果一些结晶残留于糖水中,应完全溶解后,再与蜂王浆混合。“鲜的蜂王浆”是在前 12个月内从蜂巢内收集到并冷冻保存的蜂王浆;为避免每次试验都对整个批次的鲜蜂王浆进行解冻,可将鲜蜂王浆分成 5g一份,在 ≤-10℃下保存。如果可证明市售蜂王浆的性质与实验室的历史数据一致,例如幼虫期的死亡率不超过 15%,可接受市售的蜂王浆。宜对每批蜂王浆都进行多组分残留物分析,验证其未受污染(主要是杀菌剂和杀虫剂)。
整个试验期间,在每次试验开始前配制好新鲜饲料并放置在 0℃~ 5℃的冰箱中储存(不应冰冻)。也可将它们提前配制好并深度冷冻保存,使用前再解冻。
图 3蜜蜂幼虫毒性试验主要步骤示意图
7.3.2试验溶液
通常用反渗透水溶解受试物。对于难溶的受试物,可使用溶剂(宜采用丙酮)助溶来制备贮备液。在这种情况下,应在常规的空白对照组中增加一个溶剂对照组。如果用有机溶剂,用量要尽可能低;如果用丙酮,用量不应超过第四天( D4)最终饲料投喂量的 5%。
宜使用反渗透水或溶剂(如果是难溶化合物)将贮备液稀释成五个不同浓度的受试物溶液,宜在对幼虫处理之前,使用带有过滤头的一次性吸管进行稀释。如果用水溶解受试物,饲料中受试物溶液的量不应超过最终投喂饲料量的 10%(例如, D4投喂量为 30 μL,最多只能加入 3 μL受试物溶液),如果用丙酮溶解,不应超过 5%(例如, D4投喂量为 30μL,最多只能加入 1.5 μL受试物溶液)。
为了分析测定受试物的浓度,贮备液样品应在 -10℃以下冷冻保存。
8试验程序8.1暴露的条件
培养板单独的一个小格放入一只幼虫作为一个试验单元。从三个蜂巢中的每个蜂巢最少取 12只幼虫,按每个受试物浓度、空白对照组以及参比物程序对照组放在同一培养板上。每次试验用到的对照组和试验组有:
-空白对照组(无溶剂)(最少 12只幼虫 ×3个蜂巢 =最少 36只幼虫)
-溶剂对照组,如有(最少 12只幼虫 ×3个蜂巢 =最少 36只幼虫)
-五个受试物处理组,即 5个按几何级数递增的受试物浓度组(每个浓度最少有 12只幼虫
×3个蜂巢 =最少 36只幼虫),浓度间隔系数不超过 3,浓度能覆盖到 LD50;另外,如果
进行限度试验(见 8.3),取 100μg(有效成分或受试物) /幼虫和最大实际溶解浓度中较
低者作为一次暴露剂量。
-参比物程序对照组,乐果暴露剂量为 8.8μg/幼虫(最少 12只幼虫 ×3蜂巢 =最少 36只幼虫)每次试验总共需 48孔培养板 7个~ 8个(如果用溶剂)。每组从三个蜂巢中分别取最少 12只幼虫,作为给定受试物处理浓度的一个平行组,并在这些微孔培养板上验证。
试验过程中,所有培养板要在黑暗的条件下进行试验。整个试验应在 34℃~ 35℃的培养箱中进行。温度可出现一定的偏差,但不应低于 23℃或高于 40℃,每 24 h出现的偏差不应超过一次,且一次持续的时间不应超过 15min。
8.2预试验
为估计 LD50的范围,宜进行预试验。预试验中受试物剂量按几何级数递增的间隔系数在 5~10之间。
8.3限度试验
在某些情况下(例如预计某种受试物可能毒性很低,或某种化学品难溶于水),为了证明 LD50比某限度值更大,可按限度剂量 100μg(有效成分或受试物) /幼虫,进行限度试验。对于达不到此剂量的难溶化学品,按最大实际溶解浓度进行限度试验。将来自 3个不同蜂巢的最少 12只幼虫分为 3个重复组来进行限度剂量试验,相应的空白对照组及参比物程序对照组也需同样数量的幼虫。如果统计学上与空白对照组相比,发生明显死亡,应完成本标准规定的全部试验。
8.4幼虫的收集
在第一天( D1),将带有第一虫龄幼虫的蜂坯从蜂巢中取出,在避免温度波动的前提下,放在一个隔离容器中转移到实验室,随后保存在室温条件下(不低于 20℃)。在通风橱或其它洁净条件下将幼虫移入已投加饲料 A的育王台基。为了避免由幼虫之间个体差异所产生的偏差,宜收集新孵化的幼虫,即还没有变为“ C”型的幼虫。每个蜂巢对应某几块培养板,将装有幼虫的育王台基随机放入对应培养板的孔中。一共 3组平行,从三个蜂巢中分别最少取 12只幼虫,在第四天( D4)对其进行受试物暴露;因此,在试验第一天( D1)开始时,可从每个蜂巢中取出超过这一数量的幼虫。
另一种做法,可在第四天( D4)受试物暴露前随机选择幼虫,进行随机分配。
8.5幼虫的转移和饲养
饲料投喂前要放在培养箱中加热。宜在加热板上维持在 34℃~ 35℃,任何时候不应超过 35℃。可使用装有一次性枪头的微量移液枪为每个育王台基中的幼虫投喂饲料。在第一天( D1),每育王台基投喂 20 μL饲料 A。从蜂巢中小心地取出一只幼虫,用移液枪或毛笔将其转移到一个育王台基中的饲料表面。当一个培养板装满来自一个蜂巢的 12只幼虫后,将其放在培养箱中密封容器内的单独一层。在放进培养板之前,该容器已在培养箱中调节到 34℃~ 35℃。在整个实验过程中,尽可能密闭(见图 4)。
图 4幼虫培养设备
除了第二天(D2)不投喂以外,所有幼虫每天投喂 1次。宜先在加热板上预热饲料,但不应超过 35℃,再用装备透明无菌的一次性枪头的移液枪按图 3的计划表描述进行投喂。应根据幼虫的生长调整每只幼虫的饲料量。投喂时应注意避免饲料接触或淹没幼虫。饲料要沿着育王台基的格壁,放在幼虫旁边。到投喂时刻,即使先前加入的饲料还未全部吃完,也应照常添加。在整个实验结束后,未吃完饲料的情况应记录并写入报告。
8.6试验溶液中受试物的单次添加
在第四天( D4),从三个蜂群中每个选最少 12只营养充足的幼虫,加入 30 μL混有受试物溶液的饲料C。通常在第四天( D4)试验操作开始之前,将适当浓度受试物溶液与饲料 C混合。如已证明该物质在饲料中稳定,可提前配制,但在报告中应说明。在第四天( D4),每个试验组溶液(含有饲料的)都应用不同的微量移液枪投喂,避免交叉污染。
8.7试验终止
在第七天( D7),计算死亡率,在 ≤-10℃冷冻培养板,试验结束。
8.8结果观察
在第四天( D4)之后为化学品暴露阶段,在第五天( D5)和第六天( D6)投喂的同时检查并记录死亡量,在第七天( D7)结束试验。僵硬不动的幼虫,或用移液枪、毛笔触碰没反应的幼虫,按死亡记录。
在投喂的时候,为保持清洁,将死去的幼虫有条不紊地取出。
其它观察到的现象也应记录,有助于解释死亡的原因。在第七天( D7)应将先前未吃完的饲料(定性)记录下来。
9质量保证与质量控制
满足以下要求,试验结果有效:——从第四天( D4)到第七天( D7),对照组的幼虫的累积死亡率应 ≤15%。
——到第七天( D7),参比物程序对照组中幼虫累积死亡率应 ≥50%(见 10.1)。
10 数据与报告
10.1数据统计分析和 LD 50的计算
通过雅培公式 [11]校正后,用死亡幼虫占试验开始时幼虫总数的百分比表示死亡率:
(P  . T)
M .. 100% …………………………………………… (1)
S
(% P . %T )
M .. 100% ………………………………………… (2)
100  . %T
式中:
M  ——用死亡幼虫占初始总数(即试验开始时幼虫的数目)的百分比表示校正后的死亡率;
P  ——受试物处理组死亡幼虫的数目;
T ——空白对照组死亡幼虫的数目;
S ——空白对照组存活幼虫的数目;
%P ——受试物处理组的死亡百分比;
%T ——空白对照组死亡百分比。
列表汇总出每个受试物处理组、空白对照组和参比物程序对照组的数据,记录使用幼虫的数量,在 D5、D6和D7的死亡量(即分别为受试物处理后的 24 h、48h和72 h)。用适当的统计学方法分析死亡数据(如概率单位分析、移动平均、二项式概率等) [8][9]。在每个推荐的观察时间点绘制剂量反应曲线(即,受试物处理后的 24 h、48 h和72 h),在 95%置信限计算曲线斜率和半数致死量( LD50)。用每只幼虫多少 μg受试物表示 LD50。
10.2试验报告
试验报告应包括以下内容:
a) 受试物和参比物:
.通用名、化学名、 CAS号、结构式及相关的物理化学特性;
.化学鉴定数据,包括纯度。

b) 试验物种:
.蜜蜂的来源、种和亚种、供应商来源(如已知)以及所用的培养条件;
.试验中所用的蜂群的健康状况。

c) 试验条件: .试验的地点和日期; .试验系统的描述:所用培养板的类型,每个浓度受试物处理组和对照组所用幼虫的数量,
所用溶剂及其浓度(如有),受试物的试验浓度; .孵化条件:温度(平均值、标准偏差、最小值和最大值)以及相对湿度。
d)试验结果:
. 每个浓度的受试物处理组、空白对照组和参比物程序对照组中,确认死亡幼虫的数目和百分比;
.贮备液中受试物的名义浓度和实测浓度。实测浓度与名义浓度的偏差应在 20%范围内; . D5、D6和 D7的死亡量和 D7置信区间为 95%的 72h-LD50,拟合模型曲线图,浓度 -反应
曲线以及它的标准误差,用于测定 LD50的统计学 /数学方法;
.其他观察到的现象,包括试验结束时未吃完饲料的量;
.结果讨论。
e)对本标准的任何偏离及相关解释。

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